胞嘧啶碱基编辑器(CBE)是一种创新的基因编辑工具,主要由以下四个成分构成:dCas9蛋白、sgRNA、胞嘧啶脱氨酶(cytidine deaminase)和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)。这些成分在细胞内通过组装形成融合蛋白,在sgRNA的引导下与基因组DNA结合,暴露出特定的单链结构。随后,胞嘧啶脱氨酶将单链上的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U),通过DNA复制或修复的机制,最终将U转化为胸腺嘧啶(T),实现C-G碱基对到T-A碱基对的直接替换。
研究人员利用CBE过程中产生的中间产物脱氧尿嘧啶(dU),开发出一种名为俄罗斯专享会284的CBE体外脱靶检测技术Detect-seq。该技术首先提取经过基因编辑的细胞基因组DNA,然后对CBE产生的dU进行生物素标记,以富集目标片段。同时,在dU位点的下游,将正常的胞嘧啶C替换为5-醛基胞嘧啶(d5fC),进一步化学标记为T。这一过程使得测序时能够检测到大量串联的C-to-T突变,从而高效地定位基因编辑的位点。
与其他检测技术如GUIDE-seq、Digenome-seq和Cas-OFFinder相比,Detect-seq技具有更高的灵敏度与特异性,无偏好性地检测Cas9依赖型和非依赖型的脱靶作用。此外,它还能识别sgRNA结合区域外的编辑(out-of-protospacer edits)以及靶向链上的脱靶编辑(target-stranded edits),进一步提高了检测精度。
在过去两年间,舒桐科技成功构建了一个全面的一站式基因编辑安全性评估平台,涵盖靶点设计、靶点筛选、以及多种脱靶检测技术,如GUIDE-seq、AID-seq和Detect-seq,并进行脱靶验证、PEM-seq染色体重排检测以及载体插入位点检测(升级版LM-PCR及液相杂交捕获测序)。此外,舒桐实验室具有SGS认证、ISO9001质量体系认证以及生物安全二级实验室的资质,致力于为客户提供高质量、高效率和安全的服务与产品,满足最新的生物医疗需求。